超微量分光光度計是一種用于測量微量樣品吸光度的儀器，通常用于核酸和蛋白質(zhì)的濃度測量。

主要特點(diǎn)：

1.能夠測量微量樣品的吸光度，通常在納升至微升級別。

2.高靈敏度和精確度，能夠準(zhǔn)確測量核酸和蛋白質(zhì)的濃度。

3.通常采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測量。

4.一般具有緊湊的設(shè)計和易操作的特點(diǎn)。

工作原理：

核酸和蛋白質(zhì)在紫外-可見光波長范圍內(nèi)具有特定的吸光特性。

通過將樣品放置在光路中，利用光源照射樣品，測量樣品在特定波長下透射或反射的光強(qiáng)，即吸光度。根據(jù)樣品在特定波長下的吸光度值，結(jié)合已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)ｉT的軟件，可以計算出核酸或蛋白質(zhì)的濃度。

超微量分光度計是一種常用的測定DNA和RNA濃度的方法。

通過測量特定波長下的光密度（OD值），可以間接計算出核酸的濃度。

以下是該方法的基本原理和操作步驟：

OD值的含義

OD是optical density的縮寫，表示被檢測物質(zhì)吸收的光密度。由于核酸中的堿基具有共雙鍵結(jié)構(gòu)，因此它們具有紫外光吸收特性。

不同波長的吸收峰

OD260：DNA雙鏈的吸收峰，主要反映DNA的濃度。
OD280：芳香族氨基酸的吸收峰，主要用于判斷蛋白質(zhì)污染程度。
OD230：核酸提取過程中使用的鹽離子在230nm處有吸收峰，如果OD230很高，說明鹽離子濃度較高。

純度判斷

OD260/OD280的比值用于判斷RNA或DNA的純度。高純度的DNA比值應(yīng)該在1.8-2.0之間。

如果比值低于1.8，說明蛋白質(zhì)污染較嚴(yán)重；高于2.0，則說明可能有RNA污染。

操作步驟

準(zhǔn)備核酸樣品：將待測的DNA或RNA樣品溶解在適當(dāng)濃度的緩沖液中。
測量OD值：使用產(chǎn)微量分光光度計，分別測量260nm、280nm和230nm處的光密度。
計算濃度：根據(jù)已知的摩爾消光系數(shù)，計算DNA或RNA的濃度。

注意事項(xiàng) 
實(shí)驗(yàn)過程中要避免蛋白質(zhì)和鹽離子的污染，否則會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
測量時要保持樣品池和空白池的清潔，避免雜質(zhì)干擾。

常見的用途

無論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域 ,還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門 ,紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的應(yīng)用。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。

超微量分光光度計已成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。

核酸的定量

核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。

核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。

如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。

測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。

讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。

純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者~~物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。

A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

蛋白質(zhì)直接定量

是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。

蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的“背景"信息，設(shè)定此功能“開"。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。

實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移"。這是一個正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閃arburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。

蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

OD 600

實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測推斷細(xì)菌的生長密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。

OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，做出校正曲線。實(shí)驗(yàn)中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。

另外，需注意的是，測試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。